Il processo di sterilizzazione in autoclave (sterilizzatore a vapore) può essere molto difficile. Se, ad esempio, si sterilizzano liquidi o solidi (strumenti, vetreria, filtri, tessuti) per un successivo utilizzo in laboratorio, il processo di sterilizzazione deve garantire un prodotto sempre riproducibile e sterile. I prodotti sterilizzati per l'uso in laboratorio non possono essere sottoposti a test di sterilità, poiché sono contaminati dal test e quindi non possono più essere utilizzati in laboratorio.
L'autoclave ottimale per voi?
La convalida dei processi di sterilizzazione a vapore è un argomento sempre più importante per garantire risultati riproducibili e verificabili. Inoltre, gli aspetti di sicurezza devono essere presi in considerazione nella sterilizzazione a vapore in generale, ma soprattutto nella sterilizzazione dei liquidi. La sterilizzazione viene solitamente effettuata a una temperatura di 121 ⁰C. Ciò corrisponde a una pressione di vapore di circa 2 bar. Queste temperature elevate e la pressione associata possono rappresentare un rischio considerevole per l'utente se il processo di sterilizzazione a vapore è progettato o eseguito in modo errato.
La sterilizzazione dei liquidi è uno dei compiti più impegnativi in laboratorio. I processi di sterilizzazione possono richiedere tempi molto lunghi, le bottiglie devono essere aperte o almeno ventilate, parte del liquido bolle, i liquidi possono bollire e le bottiglie possono addirittura scoppiare. Un'altra domanda da porsi è se i liquidi nelle bottiglie raggiungono la temperatura di sterilizzazione desiderata (ad esempio 121 ⁰C) e quando possono essere rimossi in modo sicuro dall'autoclave una volta completato il processo di sterilizzazione.
Se si considera il processo di sterilizzazione dei liquidi, esso si compone di tre fasi:
La Figura 1 illustra graficamente le singole fasi.
La linea blu rappresenta la temperatura nel recipiente in pressione dell'autoclave, quella rossa la temperatura nel liquido. Si può notare chiaramente che la temperatura desiderata di 121 ⁰C viene raggiunta molto rapidamente nel recipiente a pressione dell'autoclave, mentre i liquidi nelle bottiglie impiegano molto più tempo per raggiungere la temperatura di sterilizzazione. L'energia termica del vapore viene trasferita alle bottiglie durante il periodo di riscaldamento tramite la condensazione del vapore. Questo processo di condensazione e il relativo trasferimento di calore richiedono un certo tempo, il che spiega la differenza di tempo tra il semplice riscaldamento del contenitore pressurizzato e il riscaldamento del liquido stesso. Il tempo necessario per raggiungere le stesse temperature nel recipiente in pressione dell'autoclave e nei liquidi è noto come tempo di equalizzazione.
Molte autoclavi utilizzate oggi nei laboratori non sono ancora dotate di una misurazione della temperatura in un recipiente di riferimento. La temperatura esatta del liquido da sterilizzare non viene quindi registrata e non può essere utilizzata per controllare il processo di sterilizzazione. Queste autoclavi iniziano il tempo di sterilizzazione quando la temperatura desiderata viene raggiunta nel recipiente in pressione dell'autoclave. Il tempo di equalizzazione necessario ai liquidi per raggiungere la temperatura desiderata non viene preso in considerazione. Pertanto, i liquidi non raggiungono mai la temperatura di sterilizzazione di 121 ⁰C, ad esempio, il che significa che il processo di sterilizzazione non è più biologicamente efficace. A seconda della resistenza dei microrganismi da inattivare, questi vengono inattivati solo parzialmente o non vengono inattivati affatto.
Figura 1 - Processo di sterilizzazione / fasi
Misurazione della temperatura in un recipiente di riferimento
Misurando la temperatura in un recipiente di riferimento con un sensore di temperatura, è possibile determinare la temperatura esatta del liquido da sterilizzare e controllare il processo di sterilizzazione. Il tempo di sterilizzazione inizia solo quando il liquido raggiunge la temperatura di sterilizzazione desiderata. A tale scopo, il recipiente di riferimento viene riempito d'acqua. È importante che le dimensioni e il livello di riempimento del recipiente di riferimento corrispondano a quelli del recipiente più grande riempito con il liquido da sterilizzare.
Il sensore di temperatura per la misurazione in un recipiente di riferimento è quindi necessario per garantire il raggiungimento della temperatura di sterilizzazione nel liquido. Tuttavia, è anche necessario garantire una temperatura di prelievo sicura dopo la sterilizzazione. In un'autoclave, i liquidi vengono riscaldati ben oltre il normale punto di ebollizione (100 ⁰C). Il calore introdotto nel liquido, unito alla sovrapressione associata, può comportare notevoli rischi per l'operatore di un'autoclave. Ad esempio, può verificarsi un ritardo di ebollizione, il che significa che il liquido inizia a bollire spontaneamente quando l'autoclave viene aperta. Questa ebollizione spontanea crea un'onda di pressione di vapore e liquido caldo che fuoriesce dai recipienti, simile a un geyser. 1 litro d'acqua produce 1000 litri di vapore!
A causa di questo considerevole potenziale di pericolo, gli sterilizzatori a vapore utilizzati per la sterilizzazione dei liquidi sono soggetti alle relative normative. La norma DIN EN 61010-2-040 stabilisce che gli sterilizzatori a vapore per la sterilizzazione di liquidi devono essere dotati di dispositivi di sicurezza che impediscono l'apertura dell'autoclave fino a quando i liquidi non si sono raffreddati a una temperatura di prelievo sicura per l'utente. La norma definisce una temperatura di prelievo sicura come 20K al di sotto del punto di ebollizione dell'acqua a pressione atmosferica. Ciò corrisponde a una temperatura di prelievo sicura di 80 ⁰C. Le moderne autoclavi sono dotate di un blocco della porta dipendente dalla temperatura e dalla pressione. Questo impedisce l'apertura dell'autoclave finché il recipiente è in pressione e la temperatura misurata nel liquido è superiore agli 80⁰C richiesti.
Il raffreddamento dei liquidi alla temperatura di rimozione sicura può richiedere molto tempo. Una dimensione comunemente utilizzata per le autoclavi nei laboratori è un'autoclave con una capacità del recipiente in pressione di circa 150 litri. Se l'autoclave è completamente carica di bottiglie contenenti il liquido da sterilizzare, un intero ciclo di sterilizzazione può durare fino a 10 ore. Ciò significa che non è possibile completare nemmeno un processo di sterilizzazione in un giorno lavorativo. È quindi consigliabile dotare l'autoclave di un sistema di raffreddamento, che riduce significativamente il tempo complessivo del batch ed elimina ulteriori rischi e svantaggi nella sterilizzazione dei liquidi.
Raffreddamento rapido - massimizzare la produttività e la sicurezza
Esistono due tipi fondamentali di sistemi di raffreddamento per le autoclavi.
Il raffreddamento perevaporazione è probabilmente il tipo di raffreddamento più comunemente utilizzato nelle autoclavi. Possono essere, ad esempio
Tutti i tipi di raffreddamento sopra descritti presentano gravi svantaggi nella sterilizzazione dei liquidi e, se il processo di sterilizzazione non viene eseguito correttamente, possono rappresentare un rischio potenziale considerevole, poiché questo tipo di raffreddamento richiede che il liquido venga raffreddato fino all'ebollizione.
Al momento dell'acquisto di un'autoclave, è quindi consigliabile definire esattamente le applicazioni per cui verrà utilizzata e come dovrà essere equipaggiata in termini di produttività e sicurezza.
Raffreddamento per irraggiamento
Il raffreddamento per irraggiamento (raffreddamento rapido con pressione di supporto) presenta notevoli vantaggi rispetto al raffreddamento per evaporazione. Con il raffreddamento rapido con pressione di supporto, l'intera superficie del contenitore pressurizzato viene raffreddata con acqua fredda mediante serpentine di raffreddamento esterne. Prima di attivare il raffreddamento dopo la fase di sterilizzazione, il vapore nel contenitore in pressione viene sostituito da aria compressa filtrata sterile. L'aria compressa impedisce in modo affidabile l'ebollizione del liquido durante la fase di raffreddamento. Il calore viene trasferito dal liquido alle pareti fredde del contenitore pressurizzato per irraggiamento, raffreddando così il liquido.
Il raffreddamento rapido con pressione di supporto consente un notevole aumento della produttività, in quanto i tempi di processo sono notevolmente ridotti rispetto all'autoraffreddamento. Mentre l'autoraffreddamento richiede ancora fino a 10 ore per un intero processo di autoclavaggio, il tempo di raffreddamento può essere ridotto fino al 60% con il raffreddamento rapido con pressione di supporto, a seconda della quantità di carico. Inoltre, tutti i rischi e gli svantaggi descritti per il raffreddamento per evaporazione (ritardo nell'ebollizione, perdita di liquido, ebollizione, assenza di raffreddamento per le bottiglie ben chiuse) sono eliminati in modo affidabile, poiché il liquido non bolle più. Con questo tipo di raffreddamento, le bottiglie possono essere riempite fino al livello massimo di riempimento (aumento della produttività dal 50 al 70%) e si possono utilizzare anche bottiglie ben chiuse. Non è necessario aprire o adescare le bottiglie.
Ottimizzare ulteriormente i tempi di processo
Le moderne autoclavi offrono la possibilità di ottimizzare ulteriormente il raffreddamento dei liquidi in moduli. Questo aumenta ulteriormente la produttività, ma ha anche un impatto sulla qualità dei liquidi da sterilizzare. Molti liquidi contengono ingredienti poco stabili al calore. Sebbene i liquidi debbano essere sterilizzati, il tempo di esposizione al calore deve essere il più breve possibile, in modo da non influenzare negativamente gli ingredienti termostabili.
Modulo 1 - Ventilatore centrifugo
Durante la fase di raffreddamento, il ventilatore radiale genera un flusso d'aria nel recipiente a pressione dell'autoclave. Questo flusso d'aria spinge il calore dalle bottiglie alle pareti del contenitore pressurizzato, che vengono raffreddate dal rapido raffreddamento con la pressione di supporto. Questo processo può ridurre il tempo di raffreddamento fino al 70% rispetto all'autoraffreddamento.
Figura 4 - Raffreddamento con pressione di supporto e ventilatore radiale
Modulo 2 - Ultracooler
L'Ultracooler è uno scambiatore di calore aggiuntivo, raffreddato ad acqua, integrato direttamente nel recipiente in pressione dell'autoclave. Ciò consente di estrarre il calore dalle bottiglie direttamente dove si trova: nel recipiente in pressione. Grazie al trasferimento di calore notevolmente migliorato, il tempo di raffreddamento può essere ridotto fino al 90% rispetto all'autoraffreddamento.
Nota: poiché il ventilatore radiale e l'ultrafreddo sono installati all'interno del recipiente a pressione, è necessario prestare attenzione affinché non riducano lo spazio disponibile dell'autoclave.
Quando si sterilizzano i solidi (ad esempio strumenti, vetreria vuota, puntali di pipette in scatole, filtri e tessuti) e quando si distruggono i rifiuti in sacchi di distruzione, occorre fare attenzione a creare un'atmosfera di vapore esattamente dove è necessario. In particolare, sul e nel prodotto da sterilizzare. Molte autoclavi non rimuovono in modo affidabile l'aria dall'autoclave e dal prodotto. Se l'aria rimane nell'autoclave e nel prodotto, non c'è alcun effetto sterilizzante, poiché solo il vapore trasporta l'energia termica necessaria per inattivare in modo affidabile i microrganismi.
Sfiato inefficace
Le figure 5 e 6 mostrano uno sfiato inefficace utilizzando l'esempio di una scatola con puntali per pipette e un sacchetto di distruzione. Se l'autoclave viene semplicemente riscaldata, l'aria viene espulsa e si crea un'atmosfera di vapore nel recipiente a pressione dell'autoclave, mentre l'aria rimane nel prodotto da sterilizzare. L'aria rimanente nel prodotto impedisce al vapore di penetrare dove la sua energia termica è necessaria per ottenere l'effetto sterilizzante.
L'aria alla stessa temperatura del vapore (ad esempio, 121 ⁰C) contiene molte volte meno energia termica. Per i prodotti che non possono essere sterilizzati in atmosfera di vapore, esistono sterilizzatori ad aria calda, che però sterilizzano a temperature più elevate (da 180 a 250 ⁰C) e per un tempo molto più lungo (fino a diverse ore di sterilizzazione). L'effetto sterilizzante dell'aria a temperature tipicamente utilizzate negli sterilizzatori a vapore comprese tra 121 ⁰C e 134 °C e con un tempo di sterilizzazione compreso tra 3 e 20 minuti è quindi praticamente inesistente.
Figura 5 - Sfiato inefficace per i solidi
Sfiato efficace
Per rimuovere completamente e in modo riproducibile l'aria dall'autoclave e dal prodotto da sterilizzare, è necessario utilizzare un pre-vuoto frazionato. A tale scopo, l'autoclave è dotata di un sistema di vuoto. Durante la fase di riscaldamento, vengono utilizzati cicli di vuoto per rimuovere attivamente l'aria, seguiti da getti di vapore. Di norma, viene utilizzato un pre-vuoto a triplo frazionamento, ma possono essere necessari più frazionamenti a seconda del prodotto.
Essiccazione dei solidi - Superdry
Per l'essiccazione, i solidi come gli strumenti o la vetreria vuota vengono solitamente collocati in una cabina di essiccazione dopo il processo di sterilizzazione. Le moderne autoclavi consentono di essiccare i solidi direttamente dopo il processo di sterilizzazione. Sterilizzazione ed essiccazione in un unico processo. Non è necessaria un'ulteriore manipolazione del materiale da sterilizzare con il rischio di ricontaminazione.
La sterilizzazione di sostanze biologiche pericolose rappresenta una sfida particolare. Durante la fase di riscaldamento, l'aria nell'autoclave viene sostituita dal vapore. A tal fine, l'aria viene allontanata dall'autoclave e rilasciata nel locale in cui è installata l'autoclave.
Il TRBA 100 - Regole tecniche per gli agenti biologici - richiede che l'aria di scarico del processo di un'autoclave nei laboratori sia trattata a partire dal livello di sicurezza S2, poiché tale aria di scarico potrebbe essere contaminata da microrganismi provenienti dal prodotto da sterilizzare. A tal fine è necessario utilizzare un processo adeguato. Per le autoclavi, di solito si tratta di filtrazione. A tale scopo, l'autoclave è dotata di un filtro dell'aria di scarico. Tutta l'aria espulsa dall'autoclave viene convogliata attraverso il filtro e i microrganismi vengono trattenuti al suo interno. Il filtro viene sterilizzato "in linea" durante il processo di sterilizzazione, per inattivare i microrganismi in esso trattenuti. TRBA 100 tratta solo l'aria di scarico dell'autoclave, ma non la condensa prodotta. Durante il processo di sterilizzazione, il vapore si condensa sul prodotto e si trasforma in acqua (condensa). Anche quest'acqua può essere potenzialmente contaminata da microrganismi. Pertanto, la condensa deve rimanere nell'autoclave durante il processo di sterilizzazione e deve essere sterilizzata "in linea" prima di essere scaricata nello scarico dopo una sterilizzazione riuscita.
Durante la qualificazione, si verifica se un dispositivo è adatto all'uso previsto e se un processo, ad esempio un processo di sterilizzazione, può essere eseguito sempre con lo stesso risultato (riproducibile), un prodotto sterile, tenendo conto del prodotto da sterilizzare.
In linea di principio, il processo di qualificazione si divide in tre parti principali:
Lo scopo della qualificazione e della convalida è quello di fornire una prova documentata che un dispositivo è adatto all'uso previsto.
L'effetto sterilizzante di un processo di sterilizzazione a vapore viene verificato nella OQ (camera vuota) e nella PQ (con il prodotto) utilizzando dispositivi di misurazione esterni per la temperatura e la pressione e con l'aiuto di bioindicatori basati su Bacillus stearothermophilus. Mentre i dispositivi di misurazione esterni per la temperatura e la pressione forniscono la prova che il sistema di controllo dell'autoclave visualizza e documenta valori affidabili ed esegue il processo di sterilizzazione entro le tolleranze definite, i bioindicatori forniscono la prova biologica dell'efficacia. Per il posizionamento dei bioindicatori, è necessario determinare in quali aree degli articoli da sterilizzare è più difficile ottenere l'efficacia biologica. È proprio in queste aree che i bioindicatori devono essere collocati per coprire il "caso peggiore", per così dire. Tutte le fasi di un IQ, OQ e PQ devono essere documentate in dettaglio. In ogni caso, è necessario uno stretto coordinamento tra l'utente e il produttore quando si esegue un IQ, OQ e PQ.
Questo articolo è stato pubblicato su GIT Labor-Fachzeitschrift, 7/2016, pagg. 14-18.
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